一些細菌在生長過程中,可以產生溶血素,使紅細胞破裂溶解,在血平板上生長時,菌落周圍可觀察到透明或半透明的溶血環,許多細菌的致病性都與溶血特性相關。由于不同細菌產生的溶血素不同,溶血能力也不相同,在血平板上的溶血現象也不相同,因此,溶血試驗常用來進行細菌的鑒定。
(1)α溶血、β溶血和γ溶血
α溶血又稱草綠色溶血,在菌落周圍可觀察到1~2mm的草綠色半透明溶血環,為高鐵血紅蛋白所致,α溶血環中的紅細胞未完全溶解,是一種不完全溶血現象,常見的產生α溶血的菌株為肺炎鏈球菌、甲型溶血性鏈球菌。
圖1 肺炎鏈球菌在血平板上的α溶血現象
β溶血又稱為完全溶血,在菌落周圍可觀察到2~4mm界限分明、完全透明的溶血環。β溶血環中的紅細胞完全溶解,是細菌產生的溶血素使紅細胞完全溶解所致,許多致病性強的菌株都可形成β溶血,如乙型溶血性鏈球菌、金黃色葡萄球菌、霍亂弧菌等。γ溶血即不溶血,菌落周圍無溶血現象。
注:制作溶血試驗用的血平板,特別是金黃色葡萄球菌的溶血試驗,通常選用脫纖維綿羊血。這是因為綿羊紅細胞的細胞膜中的神經鞘磷脂含量較高,金黃色葡萄球菌產生的β溶血素作用于神經鞘磷脂裂解紅細胞,試驗中更易觀察到溶血現象。
圖2 金黃色葡萄球菌的β溶血和糞腸球菌的γ溶血
注:部分金黃色葡萄球菌不表現β溶血
圖3 蠟樣芽胞桿菌的β溶血
注:部分蠟樣芽胞桿菌表現為α溶血
圖4 產氣莢膜梭菌的β溶血
注:產氣莢膜梭菌有兩種溶血素,能產生雙溶血環,在β溶血環外圍可隱約看到寬度約為3-5mm的不透明微弱溶血環
(2)李斯特氏菌溶血試驗
圖5 李斯特氏菌溶血試驗
單增李斯特氏菌的溶血現象較弱,直接采用劃線接種方法時在血平板上較難觀察到溶血現象,因此在《GB4789.30-2016單核細胞增生李斯特氏菌檢驗》標準中,采用穿刺接種法可以更好的觀察到李斯特氏菌的溶血現象,單增李斯特氏菌、斯氏李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌可觀察到明顯的β溶血環,英諾克李斯特氏菌無溶血。
(3)協同溶血試驗(CAMP)
一些細菌能產生CAMP因子,可促進葡萄球菌的β-溶血素溶解紅細胞的活性,因此在兩菌的交界處溶血力增加,出現箭頭狀或半月狀透明溶血區域。該試驗常用于B群鏈球菌的鑒定,也用于單增李斯特氏菌的鑒定。
試驗方法:挑取金黃色葡萄球菌ATCC25923在血平板上劃平行直線,再挑取待測菌株垂直劃線,距離金黃色葡萄球菌接種線約1mm但不要接觸,置于36℃培養24-48h。
注:為何使用金黃色葡萄球菌ATCC25923做協同溶血試驗,而不是任意一株金黃色葡萄球菌都能做?
金黃色葡萄球菌發生溶血主要靠四種溶血素:α、β、γ和δ。其中α、γ和δ溶血素又稱為“打孔毒素”,在細胞膜上形成孔道,小分子和離子可以自由進出細胞,導致細胞代謝發生紊亂,最終發生裂解。而β溶血素的溶血機理不同,是通過水解細胞膜的鞘磷脂裂解細胞。多數金黃色葡萄球菌都有兩種以上的溶血素基因高效表達,在血平板上可觀察到完全透明的β溶血環,少數金黃色葡萄球菌只有β溶血素基因高效表達或無溶血素基因表達,在血平板上微弱溶血或不溶血。
金黃色葡萄球菌ATCC25923是一株表型不完全溶血的菌株,該菌主要產生β溶血素,在血平板上溶血現象非常微弱。B群鏈球菌可以產生一種CAMP蛋白(非酶蛋白),可以與β溶血素協同作用快速裂解紅細胞,產生溶血現象。因此,在靠近金黃色葡萄球菌ATCC25923的B群鏈球菌周圍可以觀察到明顯的溶血增強現象。而其他金黃色葡萄球菌若不產生β溶血素或本身產生多種溶血素形成了完全透明的β溶血,則無法發生協同溶血或無法觀察到協同溶血現象。
圖6 無乳鏈球菌(B群鏈球菌)協同溶血試驗
圖7 李斯特氏菌協同溶血試驗
(4)神奈川現象
該試驗是副溶血性弧菌特有的溶血現象,副溶血性弧菌在普通血平板上不溶血或只呈現α溶血,但在含高鹽(7%)的人O型血或兔血以及D-甘露醇做為碳源的我妻氏瓊脂平板上可產生β溶血。副溶血性弧菌致病性越強,溶血現象越明顯。
圖8 神奈川試驗現象(左為副溶血性弧菌,右為溶藻弧菌)
(5)培養基的選擇及制備注意事項
在《GB4789.10-2016金黃色葡萄球菌檢驗》標準中,使用的是豆粉瓊脂加5%-10%的脫纖維羊血或兔血;在《GB4789.11-2014β型溶血性鏈球菌檢驗》標準中,使用的是哥倫比亞血瓊脂基礎加5%脫纖維綿羊血;在《GB4789.14-2014蠟樣芽胞桿菌檢驗》標準中,使用的是胰酪胨大豆羊血瓊脂;在《GB4789.30-2016單增李斯特氏菌檢驗》標準中,使用的是5%-8%的羊血瓊脂。其他文獻或標準中也有使用TSA或BHI補加5%-10%脫纖維羊血做成的血瓊脂。以上培養基做出來的效果基本一致,本質上都是觀察溶血效果,選擇哪種培養基并不影響結果觀察(注:神奈川試驗使用的是單獨的我妻氏培養基加入兔紅細胞制成的平板,該培養基不能用于其他溶血試驗觀察)。
注意事項:
1.血液要選用新鮮的無菌脫纖維血,制備如血液出現變色則不能使用。
2.配制培養基時,應預先將血液溫育到40-50℃左右,待培養基冷卻至50℃左右時加入血液,輕輕搖勻。若血液與培養基溫差過大,制成的平板易出現凝塊。若搖晃幅度過大,易產生大量氣泡,制成的平板不平整。
3.血液對溫度比較敏感,加入血液時培養基溫度不能過高,加入血液混勻后應立即倒平板,不能長時間保溫,否則會導致制成的平板顏色偏深。
4.制成的平板不宜過厚,15mL-20mL為宜,平板過厚不利于觀察溶血環。
5.制成的平板應在2-8℃左右低溫冷藏,不宜儲存過久,若儲存過程發現平板變黑或變透明,則不能使用。
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